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21.09.2005:
   21.09.2005

Rambler's Top100
  

Kalziumausstoß aus den intrazellulären Depots in der Zellkultur der T-zellulären Lymphadenosis des Menschen H-9 unter dem Einfluss des Präparates Sevit Forte (ein Skvalen-Derivat)

 

Dotsenko A.N. (MD, PhD)
Geschlossene Aktiengesellschaft Medizinisches Zentrum Primavera Medica namens A.P. Chochlov Moskau,
Belokhvostov A.S. (MD, PhD)
Föderales wissenschaftlich-klinisches Zentrum für Blutforschung, Onkologie und Immunologie des Russischen Ministeriums für Gesundheitswesen, Moskau.
Zusammenfassung
Die IP3-Rezeptoren der Kalziumkanäle regeln die Verteilung des intrazellulären Kalziums. Die Störung dieses Prozesses führt zur bösartigen Transformation der Zellen mit allgemeinen Phänotypmerkmalen. In dieser Untersuchung wird gezeigt, dass das Präparat Sevit Forte den Kalziumausstoß aus den intrazellulären Depots in den Zellen H-9 verursacht. Die Zunahme der Anzahl der Kalziumpositiven Zellen beginnt 2 Stunden nach der Behandlung der Zellen, und bei der kombinierten Einwirkung zusammen mit Probenezid beginnt dieser Prozess schon in 30 Minuten. Es wird die Verbindung zwischen der Einwirkung von Sevit Forte auf IP3-Rezeptoren und der Funktion der Geschwulstzellen besprochen.
 
 Schlüsselwörter:, IP3-Rezeptoren, Geschwülste, Immunophänotypisierung, Sevit Forte
 
Präambel
Es gibt allgemeine phänotypische Merkmale der bösartigen Zelltransformation. [1]. Diese Merkmale sind in vielen Aspekten mit der Neuverteilung des intrazellulären Kalziums aus dem Depot in den Kern und ins Zytoplasma verbunden. Das führt zu einer Antwort in den regulatorischen Signalkaskaden und zur Aktivierung des Systems des vesikulären Verkehrs in den Geschwulstzellen [2,3,4].
 Neulich wurde gezeigt, dass das Niveau der IP3-Rezeptoren vom Typ 1, d.h. eines wichtigen Komponenten der Kalziumkanäle auf der Kernmembran, in den bösartigen Zellen auf Kosten der Degradierung seiner mRNA mithilfe der interferierenden miRNA (iRNA) akut sinken kann. Infolge dessen kann die Beständigkeit der Geschwulst gegen die Einwirkung mehrerer Agenten steigen [5].
 In dieser Untersuchung wurde der Prozentsatz der Ca2+ enthaltenden Zellen von Lymphadenosis des Menschen H-9 mithilfe des Fluoreszenzfarbmittels Indo-1, welches für die Ca2+-Anionen spezifisch ist, an dem Durchfluss-Cytofluorimeter eingeschätzt.  
 
Materialien und Methoden 
 Als Untersuchungsmaterial galt die Zelllinie T-OLL (H-9) und Lymphozyten der gesunden Blutspender (MNC). Das Kultivierungsmedium hatte folgende Zusammensetzung: RPMI-1640 mit 10%-igem embryonalen Kalbserum + 146 g Glutamin für 500 ml + 20 mg Gentamyzin für 500 ml.
 Die Untersuchung des Gehaltes der intra- und außenzellulären Kalziumanionen (2+) in den Zellen -9 und Lymphozyten der gesunden Blutspender wurde nach der Methode der dreifarbigen Laser- und Durchfluss-Cytofluorimetrie durchgeführt. Die Zellen -9 und die Lymphozyten der gesunden Blutspender wurden ins Tablett mit 24 Löchern für Kultivierung je 1,0 ml pro ein Loch in der Konzentration von 250x103/ ml ausgepflanzt. Das Präparat Sevit Forte wurde in der Konzentration von 3 Mikroliter/ml einzeln oder zusammen mit dem Ionomycin (1 Mikrogramm/ml) und Probenezid (1 Millimol) 10 Minuten, 30 Minuten und 2 Stunden vor der Untersuchung hinzugefügt. In die Kontrolllöcher wurde eine entsprechende Menge des Kultivierungsmediums, des Ionomycins oder Probenezids, hinzugefügt. Nach der Inkubation wurde die Kultur innerhalb von 10 Minuten mit einer Fluoreszenzfarbe Indo-1 (2 Mikrogramm/ml), welche für die 2+-Anionen spezifisch ist, gefärbt. Die Zellen wurden in einem Phosphatpuffer gewaschen. Die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Wellenlänge von 370 nm mit einem Durchfluss-Cytofluorimeter eingeschätzt. Die Fluoreszenzanalyse erfolgte mit einem Durchfluss- und Laser-Cytofluorimeter "Calibur" ("Becton Dickinson") unter der Benutzung der Software "Cell Quest" durchgeführt.
 Die Einschätzung des Niveaus der spontanen und induzierten Apoptose der Zellen wurde unter der Verwendung der Reaktive des Satzes ANNEXIN V KIT("Becton Dickinson") durchgeführt. Die Zellen (H-9 und Lymphozyten der gesunden Blutspender) wurden in den Reagenzgläsern in einer Konzentration von 1106/ml inkubiert. Sevit Forte wurde in den Konzentrationen von 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 Mikroliter/ml zugefügt. In die Vergleichsreagenzgläser wurde eine entsprechende Menge des Kultivierungsmediums zugefügt. Die Zellen wurden 2 bzw. 6 Stunden in einem 2 Inkubator bei 370 inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Anteil der apoptotischen Zellen im Durchfluss-Cytofluorimeter bewertet, es wurde eine Analyse der Fluoreszenzintensität im -Bereich bei 10000 Zellen durchgeführt. Die Analyse erfolgte unmittelbar nach der Materialentnahme (0 Stunden), nach 2 und 6 Stunden der Zellenkultivierung.
 Die statistische Computerbearbeitung der erhaltenen Materialien wurde mit den Programmen Excel, Access, Biostat durchgeführt.  
 
Ergebnisse und ihre Erörterung
 Nach der Eindringung des Präparates Sevit Forte in die Zelle erfolgte ihre Aktivierung, dabei galt als einer der wichtigsten Promotoren 2+, welcher in die Zelle aus der Umgebung oder aus dem endoplasmatischen Retikulum, d.h. dem intrazellulären 2+-Depot, gerät. Die Benutzung der Fluorchrommarke Indo-1 führte zur Absorbierung der mit Fluorchrom markierten Partikeln, welche für die 2+-Anionen spezifisch sind.
 In der Tabelle 1 ist die Einschätzung des Einflusses des Präparates Sevit Forte auf den Gehalt der 2+-Anionen in den Zellen -9 und in den Lymphozyten der gesunden Blutspender in der Suspensionskultur gezeigt. Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich, erhöhte wesentlich das Präparat Sevit Forte, während man seine Dosis vergrößerte,den Gehalt an 2+ -Anionen in den Zellen -9 und beeinflusste dabei nicht den Gehalt an 2+ in den normalen Lymphozyten. Ionomycin (es trägt zum Verkehr von 2+ in die Zelle bei) erhöhte den Gehalt der Zellen (sowohl der normalen als auch der Geschwulstzellen), welche in Bezug auf 2+ positiv geladen waren. Für die Zelllinie H-9 war dieser Effekt stärker ausgeprägt. Sevit Forte hebte die Wirkung von Ionomycin in normalen Zellen auf, in den Geschwulstzellen aber verursachte es die Steigerung des zytotoxischen Effektes. Probenezid (er blockiert den 2+-Verkehr) erhöht den 2+-Gehalt in den Geschwulstzellen und beeinflusste dabei normale Lymphozyten nicht. Sevit Forte verstärkt nicht wesentlich die Wirkung von Probenezid, sowohl in den normalen Zellen als auch in den Geschwulstzellen.  
 
Tabelle 1. Einschätzung des Einflusses des Präparates Sevit Forte auf den Gehalt der 2+-Anionen in den Zellen H-9 und Lymphozyten der gesunden Blutspender in der Suspensionskultur

 

Parametern

% der Zellen, welche Ca enthalten

9

MNC

Kontrolle

4,01

6,32

Sevit Forte, 10 Minuten

5,24

7,02

Sevit Forte, 30 Minuten

34,57

7,0

Sevit Forte, 2 Stunden

43,35

8,25

Ionomycin, 30 Minuten

20,88

11,89

Sevit Forte, 30 Minuten + Ionomycin

31,96

5,27

Probenezid 30 Minuten

16,35

6,94

Sevit Forte 30 Minuten + Probenezid

18,17

8,48

 
In der Tabelle 2 ist die Studie der Einwirkung des Präparates Sevit Forte auf den Apoptose-Prozess in den Zellen H-9 und in den normalen Lymphozyten dargestellt. Wie aus der dargestellten Tabelle 2 ersichtlich, beeinflusst das Präparat Sevit Forte bei der Inkubation innerhalb von 2 Stunden das Niveau der spontanen Apoptose in den normalen Lymphozyten nicht. Bei der Inkubation innerhalb von 6 Stunden verursacht das Präparat jedoch je nach der Erhöhung seiner Konzentration eine unwesentliche kontinuierliche Steigerung des Niveaus der spontanen Apoptose, und genauer gesagt Nekrose und das spätere Apoptose-Stadium. Das Präparat Sevit Forte verursacht bei der Erhöhung der Dosis des Präparates und bei der Inkubation innerhalb von 2 Stunden eine kontinuierliche Erhöhung des Niveaus von allen Stadien der spontanen Apoptose in den Zellen H-9, und bei der Inkubation innerhalb von 6 Stunden verursacht das Präparat eine wesentliche Erhöhung des Niveaus aller Stadien der spontanen Apoptose.
 Wie früher gezeigt [6], wurden im Präparat der DNA, welche aus dem Chromatin der Zellen der lymphoblastischen Leukose des Menschen H-9 ausgeschieden wurde, sowie in anderen bösartigen Zellen des Menschen, d.h. in der Zellkultur HeLa, welche aus dem Krebs des Gebärmutterhalses stammen, die Fraktionen der niedermolekularen DNA festgestellt. Diese Fraktionen können nach der Elektrophorese des Präparates von DNA des Chromatins festgestellt werden, welches mit der von der Ribonuklease-Aktivität befreiten Desoxyribonuklease bearbeitet wurde. Derartige RNA wurde in der DNA des Chromatins der kernhaltigen Blutzellen der gesunden Blutspender nicht festgestellt [6]. Diese RNA ist komplementär oder homolog mit dem nicht übertragbaren 3-Endfragment von m, dem IP3-Rezeptor vom Typ 1. Es kann sein, dass sie die Synthese des entsprechenden Rezeptors in den Geschwulstzellen nach dem Interferenzprinzip unterdrückt, und Sevit Forte führt zur Zerstörung der miRNA oder zu ihrer Abtrennung von Chromatin. Jedenfalls haben wir in einer anderen Untersuchung [7] gezeigt, dass Sevit Forte einen kontinuierlichen Effekt auf verschiedene Typen von Rezeptoren der Kalziumkanäle verursacht. Man kann vermuten, dass ausgerechnet damit die Ansammlung von Ca+2-Ionen in den bösartigen Lymphoblasten zu erklären ist, welche den nachfolgenden Beginn ihrer Apoptose sicherstellt.
 
Literatur
1.Rowenskij Ju.A., Wasiljew Ju.M. Morphogenetische Reaktionen der Zellen und ihre Störungen bei der Geschwulsttransformation. Aus dem Buch Kanzerogenese in der Fassung von Saridze D.G., Moskau, Vorlag Medizin 2004: 376-414. 
2.Leite M.F., Trowar E.C., Echevarria V., et al. Nuclear and cytosolic calcium are regulated independently. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(5): 2075-2980.
3.Singer-Lahat D., Ma A.L., Felder C.C.Independent induction of morphological transformation of CHO cells by receptor-activated cyclic AMP synthesis or by receptor-operated calcium influx. Biochem Pharmacol 1996;51(4):495-502. 
4.Xu Z., Williams C.J., Kopf G.S., Schultz R.M.Maturation-associated increase in IP3 receptor type 1: role in conferring increased IP3 sensitivity and Ca2+ oscillatory behavior in mouse eggs. Dev Biol 2003; 254(2): 163-71.  
5.Tsunoda T., Koga H., Yokomizo A., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor type1 (IP3R1) modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene 2005; 24(8): 1396-402.
6.Dotsenko A.N., Belochvostov A.S. Entdeckung der niedermolekularen RNA, welche dem Abschnitt der Preribosom-RNA und mRNA des IP3-Rezeptors entspricht, in den Präparaten von Chromatin der Geschwulstzellen. Probleme der Hämatologie, Onkologie und Immunologie in der Pädiatrie. 2007, Band.6 2,Seite.
7.Dotsenko A.N., Belochvostov A.S. Expression der IP3-Rezeptoren [ der erste neue Artikel in die deutsche Zeitschrift ]
Tabelle 2. Studie der Wirkung des Präparates Sevit Forte auf den Apoptoseprozess in den Zellen H-9 und in den normalen Lymphozyten.

Gruppe

0 Stunden

2 Inkubationsstunden

6 Inkubationsstunden

Annexin+ (früheres 

 Apoptose-stadium)

PI+ (Nekrose)

Annexin+PI(späteres 

 Apoptose- stadium + Nekrose)

Annexin+(früheres 

 Apoptose-stadium)

PI+ (Nekrose)

Annexin+PI(späteres 

 Apoptose-stadium+ Nekrose)

Annexin+(früheres 

 Apoptose-stadium)

PI+(Nekrose)

Annexin+PI (späteres 

 Apoptose-stadium+ Nerkose)

1. MNC 

10,8%

0,65%

0,41%

11%

0,67%

0,4%

12,1%

0,69%

0,47%

2. NC Sevit

Forte 

0,1Mikroliter

-

-

-

11,3%

0,69%

0,41%

13,1%

1,1%

0,9%

3. NC Sevit

Forte 

0,25Mikroliter

-

-

-

13.3%

0.71%

0.54%

14,2%

1,6%

1,4%

4. NC Sevit

Forte 

0,5 Mikroliter

-

-

-

14,1%

0,74%

0,57%

16,5%

1,9%

1,7%

5. MNC Sevit

Forte

1,0 Mikroliter

-

-

-

14,6%

0,75%

0,60%

17,3%

2,4%

2,1%

6. -9

12,7%

15,4%

20,1%

13%

16%

23%

14,1%

18,0%

24,1%

7. -9 Sevit

Forte

0,1 Mikroliter

-

-

-

21%

18,3%

25,2%

30,8%

28,9%

35,6%

8. -9 Sevit

Forte

0,25Mikroliter

-

-

-

44%

21,7%

28,7%

63,1%

32,4%

39,1%

9. -9 Sevit

Forte

0,5 Mikroliter

-

-

-

58,2%

23,3%

29,6%

72,1%

35,7%

40,0%

10. -9 Sevit

Forte 

  1,0 Mikroliter

-

-

-

73,1%

25,2%

33,8%

89,4%

37,7%

44,2%


 
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