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21.09.2005:
   21.09.2005

Rambler's Top100
  

IP3-Rezeptoren in denKernen der Zellender -zellulären Lymphadenosis des Menschen H-9 unter der Einwirkung des Präparates Sevit Forte (eines Skvalen-Derivates)

Dotsenko A.N. (MD, PhD)
Geschlossene Aktiengesellschaft Medizinisches Zentrum Primavera Medica namens A.P. Chochlov Moskau,
Belokhvostov A.S. (MD, PhD)
Föderales wissenschaftlich-klinisches Zentrum für Blutforschung, Onkologie und Immunologie des Russischen Ministeriums für Gesundheitswesen, Moskau.

Zusammenfassung
 Die Störung der Verteilung von Intrazellularkalzium gilt als eines der allgemeinen Phänotypmerkmale der malignisierten Zellen. Dieses Merkmal hängt in vielen Aspekten von der Änderung des Niveaus und des Verhältnisses zwischen den verschiedenen Typen der Inositoltriphosphat-geregelten Rezeptoren der Kalziumkanäle, d.h. der IP3-Rezeptoren. In dieser Untersuchung ist es nach der Methode von Immunoblotting mit entsprechenden monoklonalen Antikörpern gezeigt, dass das Niveau von IP3-Rezeptoren des ersten und zweiten Typs in den Kernen der Zellen H-9 schneller wächst, als total in den Zellen als Reaktion auf die Einwirkung des Präparates Sevit Forte. Eine maximale Zunahme der Menge des IP3-Rezeptors vom ersten Typ erfolgt schon 30 Minuten nach der Zellenbehandlung, während sich die IP3-Rezeptoren des zweiten Typs später ansammeln. Die IP3-Rezeptoren des dritten Typs sind in den Kernen nicht in der Menge vorhanden, welche erlaubt, diese Rezeptoren mithilfe der verwendeten Methode zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse stimmen mit den von uns früher erhaltenen Angaben in dem Sinne überein, dass die Expression des Gens des IP3-Rezeptors vom Typ 1 in einer Reihe der bösartigen Zellen unter der Beteiligung der niedermolekularen RNA gestört ist. Es wird die Verbindung zwischen der Einwirkung von Sevit Forte auf die IP3-Rezeptoren und zwischen der Funktion der Geschwulstzellen besprochen.  
 
Schlüsselwörter: IP3-Rezeptoren, Geschwülste, Immunoblotting, miRNA  
 
Präambel
 Allgemeine Phänotypmerkmale der bösartigen Transformation von Zellen sind in vielen Aspekten mit der Neuverteilung des intrazellulären Kalziums aus dem Depot in den Kern und ins Zytoplasma verbunden. Das führt zur Reaktion in den regulatorischen Signalkaskaden und zur Aktivierung des Systems des vesikulären Verkehrs in den Geschwulstzellen [1, 2, 3].
 Und noch darüber hinaus wurde neulich gezeigt, dass das Niveau der IP3-Rezeptoren vom Typ 1, eines wichtigen Komponenten der Kalziumkanäle auf der Kernmembran, in den bösartigen Zellen auf Kosten der Degradierung der mRNA des Kernes mithilfe der interferierenden miRNA (iRNA) akut sinken kann. Im Endeffekt kann die Beständigkeit der Geschwulst gegen die Wirkung von mehreren Agenten steigen [4]. Wir haben in der Chromatin-Fraktion der Lymphadenosiszellen H-9 und in den Zellen HeLa, aber nicht in den Lymphozyten der gesunden Blutspender, eine niedermolekulare RNA festgestellt. Die Nukleotiden-Konsequenz dieser RNA entsprach dem 3-Endabschnitt des Gens des IP3-Rezeptors vom Typ 1, d.h. mit einer möglichen interferierenden Funktion [5].
 In dieser Untersuchung wurde nach der Immunoblotting-Methode mithilfe von 3 verschiedenen Monoklon-Antikörpern zum ersten, zweiten und dritten Typ der IP3-Rezeptoren die Menge jedes Typs der oben genannten Rezeptoren der Kalziumkanäle in den Zellkernen der Lymphadenosis des Menschen H-9 eingeschätzt.  
 
Materialien und Methoden
 Als Untersuchungsmaterial dienten eine Zelllinie T-OLL (H-9) und Lymphozyten der gesunden Blutspender (MNC). Die Zusammensetzung des Kultivierungsmediums war wie folgt: RPMI-1640 mit 10%-igem embryonalem Kalbserum, 146 mg an L-Glutamin und 20 mg an Gentamicin pro 500 ml.
 Das Präparat Sevit Forte ist das Produkt von Skvalenoxydation, welches von der ZAO Medizinisches Zentrum Primavera Medica (russisches Patent Nr. 218480 vom 16.05.2001) hergestellt wird. Das Präparat wurde in den Konzentrationen von 1 bzw. 3 Mikroliter/ml 30 Minuten, 1, 3, 6 und 12 Stunden vor der Untersuchung in die Zellen H-9 sowie in die mononukleare Fraktion der Lymphozyten der gesunden Blutspender zugegeben. Nach der Inkubation wurden die Anzahl und der Prozentsatz der toten Zellen mit der Zugabe von Trypan Blau berechnet. Das erlaubt, den Bereich von Konzentrationen zu wählen, welche für die Zellen H-9 zytotoxisch sind, erweisen aber keinen wesentlichen Einfluss auf die normalen Lymphozyten.
 Zur Vorbereitung von Kernen wurden die Zellen ins serumlose Medium RPMI1640 mit der Zugabe von 0,1 bzw. 0,2% an Triton -100 für Lysinzusatz der Zellmembranen zugefügt. Die Kerne sind mithilfe von Zentrifugieren im Saccharose-Gradient gesammelt worden, dabei war die Saccharose bei pH 7,35 von der Ribonuklease-Aktivität frei. Die Aliquoten der Fraktion von Kernen wurden durch Mikroskopie kontrolliert.
Zur Bestimmung des qualitativen Gehaltes der Eiweiße wurde die standardisierte Methodik Western Blotting verwendet. Es wurde vertikale Elektrophorese im 5%-igen und 12,5%-igen Polyacrylamid-Gel durchgeführt, und das Eiweiß wurde auf die Nitrozellulose-Membran übertragen. Die Inkubation mit den Antikörpern zu IP3R des ersten, zweiten und dritten Typs und ß-Aktin wurde in entsprechenden Konzentrationen von 1:1000, 1:1000, 1:1000 1: 2000 innerhalb von 6 Stunden durchgeführt. Als sekundäre Antikörper wurden die mit der Pyroxidase markierten Antimouse-Antikörper verwendet. Die Peroxydase-Aktivität wurde mithilfe der Chemilumineszenz-Methode eingeschätzt. Die Intensität der Eiweiß-Herstellung wurde nach der Methode der Densitometrie registriert. Die Einschätzung der Expression von Eiweißen wurde in der Kammer UVP Chemi System (BioRad) durchgeführt. Als Standardstoff wurde ß-Aktin verwendet, der Gehalt an IP3R wurde als Verhältnis zwischen ihrer Dichte und der Dichte des Eiweißes des ß-Aktins in dem zu untersuchenden Lysat ausgedrückt.
Die statistische Computerbearbeitung der erhaltenen Materialien erfolgte mit Programmen Excel, Access, Biostat.  
 
Ergebnisse und ihre Erörterung
Die Beurteilung des zytotoxischen Effektes des Präparates Sevit Forte auf die Zellen H-9 wurde in den Konzentrationen durchgeführt, welche keinen sichtbaren Effekt auf die Lymphozyten der gesunden Blutspender erzielt haben Die Konzentrationen betrugen 1 Mikroliter/ml und 3 Mikroliter/ml in der Suspensionskultur in verschiedenen Zeitabschnitten.
 Wie aus den in der Tabelle 1 dargestellten Ergebnissen ersichtlich, wurde der ausgeprägte Untergang der Zellen erst nach 12 Inkubationsstunden beobachtet.
 Der Vergleich des Expressionsniveaus des ersten, zweiten und dritten Typs von IP3R in den Kernen der Zellen H-9 ist in der Tabelle 2 und in der Abb. 1 dargestellt. Wie aus der dargelegten Tabelle 2 ersichtlich, fehlte praktisch die Expression des Kerneiweißes von IP3R des ersten Typs in den Zellen H-9. Während man das Präparat Sevit Forte in der Konzentration von Mikroliter/ml bzw. 3 Mikroliter/ml zugegeben hat, erschien dasEiweiß IP3R vom ersten Typ, dabei wurde sein maximales Niveau 1 Stunde nach dem Beginn der Inkubation von Zellen mit dem Präparat beobachtet. Das Eiweiß IP3R vom Typ 2 wird unter der Einwirkung des Präparats Sevit Forte auf die Kerne der Zellen H-9 ständig aufgefunden. Trotzdem erreicht das Niveau des Eiweißes IP3R des zweiten Typs die Maximalwerte in den Kernen der Zellen H-9 3 Stunden und nicht 1 Stunde nach dem Beginn der Zellinkubation mit dem Präparat Sevit Forte im Unterschied zu IP3R des ersten Typs.
 Es ist nicht gelungen, IP3R des 3. Typs in der Kernfraktion in den für die Analyse ausreichenden Mengen zu bestimmen. Das kann dadurch erklärt werden, dass die maximale Menge von IP3R in den Zellen H-9 und in den Lymphozyten der gesunden Blutspender von IP3R des Typs 3 und des Typs 2 vertreten ist. Der Typ 2 hat aber hauptsächlich eine Kernlokalisierung, und der Typ 3 ist breit verteilt, d.h. sowohl im Zytoplasma als auch im endoplasmatischen Retikulum.
 So hat Sevit Forte in den Kernen eine konsequente Einwirkung auf verschiedene Typen von Rezeptoren der Kalziumkanäle. IP3R vom Typ 1, welcher einen kurzfristigen Ausstoß der Kalzium-Ionen sicherstellt und die zelluläre Transduktion anlässt, sammelt sich schon in der ersten Stunde nach der Zellinkubation mit Sevit Forte an, und die IP3-Rezeptoren vom Typ 2 sammeln sich später an.
 Wie in voriger Untersuchung gezeigt [6], wo die Verteilung von Isoformen der Rezeptoren total in den Zellen bestimmt wurde, betragen die Rezeptoren IP3R des dritten Typs im Unterschied zu den Kernen den maximalen Prozentsatz von den übrigen Typen dieser Rezeptoren. Anscheinend stellen sie eine langfristige Neuverteilung des intrazellulären Kalziums, seine Ansammlung im Zytoplasma und den nachfolgenden Zelluntergang sicher. Trotzdem starten die anfänglichen Ereignisse für Neuverteilung von Kalzium und für Bestimmung des zukünftigen Schicksals der Zellen im Kern.
 Wie früher gezeigt [7], sind im Präparat der DNA, welche aus Chromatin der Zellen der Lymphoblasten-Lymphadenosis des Menschen H-9 ausgeschieden wurde, sowie in anderen bösartigen Zellen des Menschen, d.h. in der Kultur der Zellen HeLa, welche aus dem Krebs des Gebärmutterhalses stammen, die Fraktionen der niedermolekularen RNA festgestellt. Diese RNA ist komplementär und homolog dem nicht übertragbaren 3-Endfragment der mRNA, dem IP3-Rezeptor vom Typ 1. Es kann sein, dass sie die Synthese des entsprechenden Rezeptors in den Geschwulstzellen nach dem Interferenzprinzip unterdrückt, und Sevit Forte führt zur Zerstörung der miRNA oder zu ihrer Trennung von Chromatin. Die Verstärkung (schon nach 30 Minuten) der Expression des ersten Typs von IP3R in den Kernen der Zellen H-9 gilt als noch ein Argument zugunsten dieser Vermutung.  
 
Tabelle1.
Einschätzung der zytotoxischen Einwirkung des Präparates Sevit Forte auf die Zellen H-9 in der Suspensionskultur in verschiedenen Zeitabständen

Konzentration des Präparates Sevit Forte (Mikroliter/ml)

Nach 30 Minuten der Inkubation

Anzahl der Zellen im Loch, Mio./ml

% der toten Zellen

% Abweichungen von den Kontrollwerten

1. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,3 + 0,8

--

2. 1,0 n=3

0,24

6,2

-2

3. 3,0 n=3

0,23

6,4

+2

 

Nach 1 Stunde der Inkubation

4. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,2 + 0,8

--

5. 1,0 n=3

0,16

6,9

+10

6. 3,0 n=3

0,12

8,1

+28

 

nach 3 Stunden der Inkubation

7. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,3 + 0,4

--

8. 1,0 n=3

0,16

9,1

+44

9. 3,0 n=3

0,12

12,5

+98

 

nach 6 Stunden der Inkubation

10. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,1 + 0,8

--

11. 1,0 n=3

0,16

11,5

+83

12. 3,0 n=3

0,12

18,4

+192

 

nach 12 Stunden der Inkubation

13. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

5,9 + 0,8

--

14. 1,0 n=3

0,16

18,3

+190

15. 3,0 n=3

0,12

31,5

+401

Tabelle 2. Einfluss von Sevit Forte auf die Expression des ersten, zweiten und dritten Typs von IP3R in den Kernen der Zellen H-9

Konzentration des Präparates Sevit Forte (Mikroliter/ml)

Expressionsniveau der untersuchten Eiweiße in den Bezugseinheiten (Verhältnis zu ß-Aktin)

Typ 1

Typ 2

Typ 3

1. Kontrolle von-9

-

-

-

2. Sevit Forte1,0 30 Minuten

0,1

1,1

-

3. Sevit Forte 1,0 1 Stunde

0,3

1,8

-

4. Sevit Forte1,0 3 Stunden

0,1

2,2

-

5. Sevit Forte 1,06 Stunden

-

2,9

-

6. Sevit Forte 1,0 12 Stunden

-

1,2

-

7. Sevit Forte3,0 30 Minuten

0,1

1,7

-

8. Sevit Forte 3,0 1 Stunde

0,7

3,5

-

9. Sevit Forte 3,0 3 Stunden

0,9

3,9

-

10. Sevit Forte3,0  6 Stunden

0,2

1,9

-

11. Sevit Forte 3,0  12 Stunden
0,1
1,3
-

-Abwesenheit der Expression
  

 

Abb.1 . Einfluss von Sevit Forte auf das Expressionsniveau der Rezeptoren von Kalziumkanälen (IP3R) vom Typ 1() und Typ (B) in den Kernen der Zellen -9
 
A
 
B
 

 

1 Marker, 2-4 innere Kontrolle, 5. Kontrolle der Kerne von Zellen -9, 6. Kerne der Zellen H-9 nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 1,0 Mikroliter/ml innerhalb von 30 Minuten, 7.- dasselbe nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 1,0 Mikroliter/ml innerhalb von 1 Stunde, 8. nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 1,0 Mikroliter/ml innerhalb von 3 Stunden, 9.- nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 1,0 Mikroliter/ml innerhalb von 6 Stunden, 10.- nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 1,0 Mikroliter/ml innerhalb von 12 Stunden, 11. - nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 3,0 Mikroliter/ml innerhalb von 30 Minuten, 12.- nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 3,0 Mikroliter/ml innerhalb von 1 Stunde, 13. nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 3,0 Mikroliter/ml innerhalb von 3 Stunden, 14. - nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 3,0 Mikroliter/ml innerhalb von 6 Stunden, 15. - nach dem Einfluss von Sevit Forte in der Konzentration von 3,0 Mikroliter/ml innerhalb von 12 Stunden. 

 

Literatur

 1.Leite M.F., Trowar E.C., Echevarria V., et al. Nuclear and cytosolic calcium are regulated independently. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(5): 2075-2980.

2.Singer-Lahat D., Ma A.L., Felder C.C.Independent induction of morphological transformation of CHO cells by receptor-activated cyclic AMP synthesis or by receptor-operated calcium influx. Biochem Pharmacol1996; 51(4): 495-502.
3.Xu Z., Williams C.J., Kopf G.S., Schultz R.M.Maturation-associated increase in IP3 behavior in mouse eggs. Dev Biol2003; 254(2): 163-71.
4.Tsunoda T., Koga H., Yokomizo A., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor type1 (IP3R1) modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene2005; 24(8): 1396-402.
5.Dotsenko A.N., Belochvostov A.S. Entdeckung der niedermolekularen RNA, welche dem Abschnitt der Preribosom-RNA und mRNA des IP3-Rezeptors entspricht, in den Präparaten von Chromatin der Geschwulstzellen. Probleme der Hämatologie, Onkologie und Immunologie in der Pädiatrie. 2007, Band.6 2,Seite.
6.Dotsenko A.N., Belochvostov A.S.[ Artikel in der deutschen Zeitschrift]
7.Dotsenko A.N., Belochvostov A.S.[ IP3-Rezeptoren in den Zellen der T-zellulären Lymphadenosis des Menschen H-9 unter der Einwirkung des Präparates Sevit Forte (eines Skvalen-Derivaten) [ der erste neue Artikel in der deutschen Zeitschrift]

 
   ©2006