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21.09.2005:
   21.09.2005

Rambler's Top100
  

Expression von IP3-Rezeptoren in der Zellkultur von -zellulären Lymphadenosis des Menschen H-9 unter der Einwirkung des Präparates Sevit Forte (eines Skvalen-Derivates)

Dotsenko A.N. (MD, PhD)
Geschlossene Aktiengesellschaft Medizinisches Zentrum Primavera Medica namens A.P. Chochlov Moskau,
Belokhvostov A.S. (MD, PhD)
Föderales wissenschaftlich-klinisches Zentrum für Blutforschung, Onkologie und Immunologie des Russischen Ministeriums für Gesundheitswesen, Moskau.

Zusammenfassung
 Die Störung der Verteilung von intrazellulärem Kalzium ist eines der allgemeinen Phänotypmerkmale von malignisierten Zellen, welche in mehreren Aspekten von den Inositoltriphosphat-geregelten Rezeptoren der Kalziumkanäle, d.h. von den IP3-Rezeptoren abhängig ist. In dieser Untersuchung ist es nach dem Verfahren von Immunoblotting mit entsprechenden monoklonalen Antikörpern gezeigt, dass das Präparat Sevit Forte, welches den Kalziumausstoß aus dem intrazellulären Depot verursacht, das Niveau von IP3-Rezeptoren des ersten, zweiten und dritten Typs in den Zellen H-9 unterschiedlich beeinflusst. Eine maximale Zunahme der Menge des IP3-Rezeptors des ersten Typs erfolgt schon eine Stunde nach der Behandlung der Zellen, während die IP3-Rezeptoren des zweiten und dritten Typs sich später ansammeln. Wie wir in voriger Arbeit festgestellt haben, ist im Chromatin von verschiedenen bösartigen Zellen wie H-9 und HeLa, niedermolekulare RNA anwesend. Diese RNA wird in den normalen kernhaltigen Blutzellen nicht festgestellt. Sie entspricht dem nicht übertragbaren Abschnitt der mRNA des IP3-Rezeptors vom Typ 1 oder ist diesem Abschnitt komplementär.
 Es wird die Verbindung der Einwirkung von Sevit Forte auf die IP3-Rezeptoren mit der Funktion der Geschwulstzellen besprochen. 
 
Schlüsselwörter:IP3-Rezeptoren, Geschwülste, Immunoglobulin, miRNA 
 
Präambel
 Es gibt allgemeine phänotypische Merkmale der bösartigen Transformation der Zellen [1]. Diese Merkmale sind in mehreren Aspekten mit der Neuverteilung des intrazellulären Kalziums aus dem Depot in den Kern und ins Zytoplasma verbunden, und das führt zu einer Antwort in den Regulationssignalkaskaden und zur Aktivierung des Systems des vesikulären Verkehrs in den Geschwulstzellen. [2, 3, 4].
 Und noch mehr, es wurde neulich gezeigt, dass das Niveau der IP3-Rezeptoren vom Typ 1, eines wichtigen Komponenten der Kalziumkanäle auf der Kernmembran, in den bösartigen Zellen auf Kosten der Degradierung seiner mRNA mithilfe der interferierenden miRNA (iRNA) akut sinken kann. Infolge dessen kann die Beständigkeit der Geschwulst gegen die Wirkung von mehreren Agenten wachsen [5].
 In dieser Untersuchung wurde mithilfe von 3 verschiedenen Monoklon-Antikörpern zum ersten, zweiten und dritten Typ von IP3-Rezeptoren nach der Methode von Immunoblotting die Anzahl jedes dieser Rezeptoren der Kalziumkanäle in den Zellen von Lymphadenosis des Menschen H-9 eingeschätzt.  
 
Materialien und Methoden 
 Als Untersuchungsmaterial dienten die Zelllinie T-OLL (H-9) und Lymphozyten der gesunden Blutspender (MNC). Die Kultivierungssubstanz bestand aus RPMI-1640 mit dem 10%-igen embryonalen Kalbserum, 146 mg von L-Glutamin und 20 mg von Gentamyzin pro 500 ml.
 Das Präparat Sevit Forte ist das Produkt der Skvalenoxidation, welches von ZAO Medizinisches Zentrum Primavera Medica (russisches Patent Nr. 218480 vom 16.05.2001) hergestellt wird. Dieses Präparat wurde in den Konzentrationen von 1 und 3 Mikroliter/ml 30 Minuten, 1, 3, 6 und 12 Stunden vor der Untersuchung in die Zellen H-9 zugegeben und in den Konzentrationen von 1,3 und 5 Mikroliter/ml 2 Stunden und 24 Stunden vor der Untersuchung in die Zellen H-9 sowie in die mononukleare Fraktion der Lymphozyten der gesunden Blutspender zugegeben. Nach der Inkubation wurde die Anzahl und der Prozentsatz der toten Zellen berechnet, während man Trypan Blau zugegeben hat. Das erlaubt, den Bereich von Konzentrationen zu wählen, welcher für die Zellen H-9 zytotoxisch ist, hat aber auf die normalen Lymphozyten keinen wesentlichen Einfluss.
 Zur Bestimmung des quantitativen Gehaltes der Eiweiße wurde eine Standardmethodik Western Blotting verwendet. Es wurde eine vertikale Elektrophorese im 5%-igen und 12,5%-igen Polyacrylamid-Gel durchgeführt, dann hat man Eiweiß auf die Nitrozellulose-Membran übertragen. Die Inkubation mit Antikörpern zu IP3R vom ersten, zweiten und dritten Typ und zum ß-Aktin erfolgte innerhalb von 6 Stunden mit entsprechenden Verdünnungen von 1:1000, 1:1000, 1:1000 und 1: 2000. Als sekundäre Antikörper wurden die mit der Peroxydase markierten Antimaus-Antikörper benutzt. Die Peroxydase-Aktivität wurde mithilfe der Chemilumineszenz-Methode eingeschätzt. Die Intensität der Eiweißherstellung wurde mithilfe von Densitometrie bestimmt. Die Einschätzung der Expression von Eiweißen wurde in der Kammer UVP Chemi System (BioRad) durchgeführt. Als Standardstoff wurde ß-Aktin verwendet, der Gehalt der IP3R-Rezeptoren wurde als Verhältnis ihrer Dichte zur Dichte des Eiweißes von ß-Aktin im zu untersuchenden Lysat dargestellt.
 Die statistische Computerbearbeitung der gesammelten Materialien wurde in den Programmen Excel, Access und Biostat durchgeführt.  
 
Untersuchungsergebnisse und ihre Beurteilung
 Die Beurteilung der zytotoxischen Einwirkung des Präparates Sevit Forte in verschiedener Konzentrationen auf die Zellen -9 und auf die Lymphozyten von gesunden Blutspendern in der Suspensionskultur nach 2 und 24 Stunden ist in der Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1. Einschätzung der zytotoxischen Einwirkung des Präparates Sevit Forte auf die Zellen H-9 und Lymphozyten von gesunden Blutspendern in der Suspensionskultur

Konzentration des Präparates Sevit Forte (Mikroliter/ml)
-9 nach 2 Inkubationsstunden

Anzahl der Zellen im Loch Mio./ml

% der toten Zellen

% Abweichungen von Kontrollwerten

1. Kontrolle von 9, n=5

0,24+ 0,07

5,5 + 0,8

--

2. 1,0

n=3

0,24

8,7

+58

3. 3,0

 n=3

0,23

10,3

+87

4. 5,0

n=3

0,23

13,1

+138

 

-9 nach 24 Inkubationsstunden

5. Kontrolle von9,

n=5

0,24+ 0,07

5,4 + 0,8

--

6. 1,0

n=3

0,16

41,0

+645

7. 3,0

 n=3

0,12

58,3

+960

8. 5,0

n=3

0,04

87,7

+1494

 

MNC nach 2 Inkubationsstunden

1. Kontrolle von MNC, n=5

0,25+ 0,07

3,6 + 0,8

--

2. 1,0

n=3

0,25

3,8

+5

3. 3,0

 n=3

0,25

3,9

+8

4. 5,0

n=3

0,25

4,0

+11

 

MNC nach 24 Inkubationsstunden

5. Kontrolle von MNC, n=5

0,24+ 0,07

3,4 + 0,8

--

6. 1,0

 n=3

0,25

4,1

+14

7. 3,0

 n=3

0,25

4,9

+36

8. 5,0

 n=3

0,25

6,7

+86

Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich, hat sich die Zytotoxität in Bezug auf die normalen Lymphozyten weder nach 2 noch nach 24 Stunden sogar bei der maximalen gewählten Konzentration nicht geäußert. Bei der Einwirkung auf die bösartigen Lymphoblasten H- 9 in der Konzentration von 5 Mikroliter/ml innerhalb von 24 Stunden wurde der Untergang von über 87% der Geschwulstzellen registriert, bei der Konzentration von 3 Mikroliter/ml wurde der Untergang von über 57% der Geschwulstzellen registriert. Es ist klar, dass die Konzentration von 5 Mikroliter/ml für die Untersuchung der Ansammlung der Rezeptoren zu hoch ist, deswegen wurde in den nachfolgenden Untersuchungen eine Konzentration von 1 bzw. 3 Mikroliter/ml verwendet.

Die Einschätzung des zytotoxischen Effektes des Präparates Sevit Forte auf die Zellen H- 9 in der Suspensionskultur in verschiedenen Zeitabständen nach dem Inkubationsbeginn sind in der Tabelle 2 dargestellt. 
Tabelle Nr. 2. Einschätzung des zytotoxischen Effektes des Präparates Sevit Forte auf die Zellen H- 9 in der Suspensionskultur in verschiedenen Zeitabständen

Konzentration des Präparates Sevit Forte (Mikroliter/ml)
Nach 30 Minuten der Inkubation

Anzahl der Zellen im Loch (Mio./ml)

% der toten Zellen

% Abweichungen von den Kontrollwerten

1. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,3 + 0,8

--

2. 1,0 n=3

0,24

6,2

-2

3. 3,0 n=3

0,23

6,4

+2

 

nach 1 Stunde der Inkubation

4. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,2 + 0,8

--

5. 1,0 n=3

0,16

6,9

+10

6. 3,0 n=3

0,12

8,1

+28

 

nach 3 Stunden der Inkubation

7. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,3 + 0,4

--

8. 1,0 n=3

0,16

9,1

+44

9. 3,0 n=3

0,12

12,5

+98

 

nach 6 Stunden der Inkubation

10. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

6,1 + 0,8

--

11. 1,0 n=3

0,16

11,5

+83

12. 3,0 n=3

0,12

18,4

+192

 

nach 12 Stunden der Inkubation

13. Kontrolle, n=5

0,24+ 0,07

5,9 + 0,8

--

14. 1,0 n=3

0,16

18,3

+190

15. 3,0 n=3

0,12

31,5

+401

Wie aus den in der Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen ersichtlich, wurde der ausgeprägte Untergang der Zellen erst nach 12 Stunden der Inkubation beobachtet.

Der Vergleich des Expressionsniveaus des ersten, zweiten und dritten Typs von IP3R in den Zellen H-9 ist in der Tabelle 3 und in den Abbildungen 1 bis 3 dargestellt. Wie aus der dargestellten Tabelle 3 ersichtlich, beeinflusst das Präparat Sevit Forte in der Konzentration von 1 Mikroliter/ml bei der Inkubation innerhalb von 1 bis 3 Stunden die Expression von IP3R vom Typ 1 in den Zellen H-9 unwesentlich, und in der Konzentration von 3 Mikroliter/ml bei der Inkubation innerhalb einer Stunde erhöht es die Expression von IP3R vom Typ 1. Der quantitative Gehalt von Eiweiß vom Typ 1 in den Zellen H-9 ist wesentlich niedriger als der des Eiweißes von IP3R vom Typ 2. Das Präparat Sevit Forte erhöht wesentlich die Expression von IP3R vom Typ 2 in den Zellen H- 9 in der Konzentration von 3 Mikroliter/ml bei der Inkubation innerhalb von 1 bis 3 Stunden, und bei der Konzentration von 1 Mikroliter/ml beeinflusst es die Expression von IP3R vom Typ 2 weniger ausgeprägt. Das Präparat Sevit Forte in der Dosis von 3 Mikroliter erhöht die Expression von IP3R vom Typ 3 in den Zellen H-9 nach 30 Minuten, die Expression erreicht den Maximalwert in 3 Stunden und sinkt bis auf 12 Stunden nach dem Beginn. In der Konzentration von 1 Mikroliter/ml beeinflusst das Präparat die Expression von IP3R vom Typ 3 weniger ausgeprägt, das maximale Niveau wird aber auch nach 3 Stunden beobachtet. 
 
Tabelle 3. Einfluss von Sevit Forte auf die Expression des ersten, zweiten und dritten Typs von IP3R in den Zellen H-9

Die Nummer entspricht den Überschriften zu den Abbildungen
Expressionsniveau der untersuchten Eiweiße in den Bezugseinheiten (Verhältnis zu ß-Aktin)
der 1. Typ
der2. Typ
der3. Typ
1. Kontrolle
1,2
2,5
2,5
2. Sevit Forte, 1 Mikroliter,  
30 Minuten
1,3
2,6
2,7
3. Sevit Forte, 1 Mikroliter,
1 Stunde
2,1
3,9
5,5
4. Sevit Forte, 1 Mikroliter,
3 Stunden
1,3
5,3
9,6
5. Sevit Forte, 1 Mikroliter,
6 Stunden
1,1
6,1
5,8
6. Sevit Forte, 1 Mikroliter,
12 Stunden
1,1
3,8
4,7
7. Sevit Forte, 3 Mikroliter,
30 Minuten
2,2
3,2
3,9
8. Sevit Forte, 3 Mikroliter,
1 Stunde
3,7
10,7
 
7,1
9. Sevit Forte, 3 Mikroliter,
3 Stunden
2,8
12,8
11,6
10. Sevit Forte, 3 Mikroliter,
6 Stunden
2,1
5,1
7,8
11. Sevit Forte, 3 Mikroliter,
12 Stunden
1,1
4,4
5,9

Abb. 1. Einfluss von Sevit Forte auf das Niveau der Expression von IP3R vom Typ 1 in den Zellen H-9
 
Abb. 2 Einfluss von Sevit Forte auf das Niveau der Expression von IP3R vom Typ 2 in den Zellen H-9

 
Abb.3 Einfluss von Sevit Forte auf das Niveau der Expression von IP3R vom Typ 3 in den Zellen H-9
 
Abb. 4. Einfluss von Sevit Forte auf das Niveau der Expression von IP3R vom Typ 1, 2 und 3 in den Zellen
1 Sevit, 1 Mikroliter
  IP3 Expressionsniveau von IP3
, Zeit, Stunden
1 2 3 - der erste, zweite und dritte Typ
 
 
 
Abb. 5 Einfluss von Sevit Forte auf das Niveau der Expression von IP3R vom Typ 1, 2 und 3 in den Zellen H-9
3 Sevit, 3 Mikroliter
  IP3 Expressionsniveau von IP3
, Zeit, Stunden
1 2 3 - der erste, zweite und dritte Typ
 
Die größte Menge an IP3R in den Zellen H-9 und Lymphozyten der gesunden Blutspender ist bei IP3R vom Typ 3 und Typ 2 dargestellt. Der Typ 2 hat aber hauptsächlich eine Kernlokalisierung, und der Typ 3 hat eine breitere Verteilung, d.h. im Zytoplasma und im endoplasmatischen Retikulum.
 Der Vergleich des Niveaus der IP3R-Expression vom Typ 3 in den Zellen H-9 und Lymphozyten der gesunden Blutspender ist in der Tabelle 4 dargestellt. Wie aus der dargestellten Tabelle 4 ersichtlich, erhöht das Präparat Sevit Forte wesentlich die IP3R-Expression vom Typ 3 in den Zellen H- 9 in
den Konzentrationen von 1 Mikroliter, 3 Mikroliter und 5 Mikroliter bei der Inkubation innerhalb von 2 Stunden. Es beeinflusst jedoch nicht die IP3R-Expression in den normalen Lymphozyten. 
Tabelle 4. Einfluss von Sevit Forte auf das Niveau der IP3R-Expression vom Typ 3 in den Zellen H-9 und in den Lymphozyten der gesunden Blutspender 
 

Konzentration des Präparats Sevit Forte (Mikroliter/ml)

Expressionsniveaus der untersuchten Eiweiße, in Bezugseinheiten (Verhältnis zu ß-Aktin)

-9

Lymphozyten

Kontrolle

2,5

1,8

Sevit Forte, 1 Mikroliter, 2 Stunden

7,3

2,0

Sevit Forte, 3 Mikroliter, 2 Stunden

8,5

1,9

Sevit Forte, 5 Mikroliter, 2 Stunden

6,9

1,8

Sevit Forte, 1 Mikroliter, 24 Stunden

4,1

1,8

Sevit Forte, 3 Mikroliter, 24 Stunden

2,9

1,9

Sevit Forte, 5 Mikroliter, 24 Stunden

1,9

1,8

 
So übt Sevit Forte einen konsequenten Einfluss auf verschiedene Typen von Rezeptoren der Kalziumkanäle aus. IP3R vom Typ 1, welcher einen kurzfristigen Ausstoß der Kalzium-Ionen sicherstellt und die zelluläre Transduktion anlässt, sammelt sich schon innerhalb der ersten Stunde nach der Inkubation der Zellen mit Sevit Forte an. Die IP3-Rezeptoren vom Typ 2 und 3 sammeln sich später an und stellen eine langfristige Neuverteilung des intrazellulären Kalziums, seine Ansammlung in der Zytoplasma und einen nachfolgenden Zellenuntergang sicher.

Wie früher gesagt [6], sind im Präparat der DNA, welche aus dem Chromatin der Zellen der lymphoblastischen Leukose des Menschen H-9 ausgeschieden wurde, und in den anderen bösartigen Menschenzellen, d.h. in der Kultur der Zellen HeLa, welche aus Krebs des Gebärmutterhalses entstehen, die Fraktionen der niedermolekularen RNA festgestellt, welche nach der Elektrophorese des Präparats der DNA Chromatins festgestellt werden können. Das Präparat soll mit der von der Ribonuklease-Aktivität freien Desoxyribonuklease bearbeitet werden. In der DNA des Chromatins der kernhaltigen Blutzellen der gesunden Blutspender wurde gleichartige RNA nicht festgestellt [6]. Diese RNA ist komplementär und homologisch zu dem nichtübertragbaren 3-End-Fragment von mRNA, dem IP3-Rezeptor vom Typ 1. Es kann sein, dass sie die Synthese des entsprechenden Rezeptors in den Geschwulstzellen nach dem Interferenzprinzip unterdrückt. Sevit Forte führt aber zur Zerstörung der miRNA oder zu ihrer Trennung von Chromatin. 
Literatur
1.Rowenskij Ju.A., Wasiljew Ju.M. Morphogenetische Reaktionen der Zellen und ihre Störungen bei der Geschwulsttransformation. Aus dem Buch Kanzerogenese in der Fassung von Saridze D.G., Moskau, Vorlag Medizin 2004: 376-414.
2.Leite M.F., Trowar E.C., Echevarria V., et al. Nuclear and cytosolic calcium are regulated independently. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(5): 2075-2980.
3.Singer-Lahat D., Ma A.L., Felder C.C.Independent induction of morphological transformation of CHO cells by receptor-activated cyclic AMP synthesis or by receptor-operated calcium influx. Biochem Pharmacol1996; 51(4): 495-502.
4.Xu Z., Williams C.J., Kopf G.S., Schultz R.M.Maturation-associated increase in IP3 receptor type 1: role in conferring increased IP3 sensitivity and Ca2+ oscillatory behavior in mouse eggs. Dev Biol2003; 254(2): 163-71.
5.Tsunoda T., Koga H., Yokomizo A., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor type1 (IP3R1) modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene2005; 24(8): 1396-402.
6.Dotsenko A.N., Belochvostov A.S. Entdeckung der niedermolekularen RNA, welche dem Abschnitt der Preribosom-RNA und mRNA des IP3-Rezeptors entspricht, in den Präparaten von Chromatin der Geschwulstzellen. Probleme der Hämatologie, Onkologie und Immunologie in der Pädiatrie. 2007, Band.6 2,Seite. 

 
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